સમાચાર

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) એ β-galactosidase સબસ્ટ્રેટનું એનાલોગ છે, જે અત્યંત પ્રેરક છે.IPTG ના ઇન્ડક્શન હેઠળ, ઇન્ડ્યુસર રિપ્રેસર પ્રોટીન સાથે એક સંકુલ બનાવી શકે છે, જેથી રિપ્રેસર પ્રોટીનની રચના બદલાઈ જાય, જેથી તેને લક્ષ્ય જનીન સાથે જોડી ન શકાય, અને લક્ષ્ય જનીન કાર્યક્ષમ રીતે વ્યક્ત થાય.તો પ્રયોગ દરમિયાન IPTG ની સાંદ્રતા કેવી રીતે નક્કી કરવી જોઈએ?જેટલું મોટું છે તે સારું છે?
પ્રથમ, ચાલો IPTG ઇન્ડક્શનના સિદ્ધાંતને સમજીએ: E. coliના લેક્ટોઝ ઓપેરોન (તત્વ)માં ત્રણ માળખાકીય જનીનો, Z,Y, અને A હોય છે, જે અનુક્રમે β-galactosidase, permease અને acetyltransferase ને એન્કોડ કરે છે.lacZ લેક્ટોઝને ગ્લુકોઝ અને ગેલેક્ટોઝમાં અથવા એલો-લેક્ટોઝમાં હાઇડ્રોલાઇઝ કરે છે;lacY પર્યાવરણમાં લેક્ટોઝને કોષ પટલમાંથી પસાર થવા દે છે અને કોષમાં પ્રવેશ કરે છે;lacA એસીટીલ જૂથને એસીટીલ-કોએમાંથી β-ગેલેક્ટોસાઇડમાં સ્થાનાંતરિત કરે છે, જેમાં ઝેરી અસર દૂર કરવાનો સમાવેશ થાય છે.આ ઉપરાંત, એક ઓપરેટિંગ ક્રમ O, એક પ્રારંભિક ક્રમ P અને એક નિયમનકારી જનીન I છે. I જનીન કોડ એ એક રિપ્રેસર પ્રોટીન છે જે ઑપરેટર ક્રમની સ્થિતિ O સાથે જોડાઈ શકે છે, જેથી ઓપેરોન (મેટા) દબાવવામાં આવે અને બંધ.કેટાબોલિક જનીન એક્ટિવેટર પ્રોટીન-સીએપી બાઈન્ડિંગ સાઈટ માટે એક બંધનકર્તા સાઈટ પણ છે જે ઈનિશિએટિંગ સિક્વન્સ પીની અપસ્ટ્રીમ છે. પી સિક્વન્સ, ઓ સિક્વન્સ અને સીએપી બાઈન્ડિંગ સાઈટ મળીને લાખ ઓપેરોનના નિયમનકારી ક્ષેત્રની રચના કરે છે.જનીન ઉત્પાદનોની સંકલિત અભિવ્યક્તિ પ્રાપ્ત કરવા માટે ત્રણ ઉત્સેચકોના કોડિંગ જનીનો સમાન નિયમનકારી ક્ષેત્ર દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે.

લેક્ટોઝની ગેરહાજરીમાં, લેક ઓપેરોન (મેટા) દમનની સ્થિતિમાં છે.આ સમયે, PI પ્રમોટર સિક્વન્સના નિયંત્રણ હેઠળ I ક્રમ દ્વારા વ્યક્ત કરાયેલ લાખ રિપ્રેસર O ક્રમ સાથે જોડાય છે, જે RNA પોલિમરેઝને P ક્રમ સાથે બંધન થતા અટકાવે છે અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનની શરૂઆતને અટકાવે છે;જ્યારે લેક્ટોઝ હાજર હોય છે, ત્યારે લેક ​​ઓપેરોન (મેટા) પ્રેરિત થઈ શકે છે આ ઓપેરોન (મેટા) સિસ્ટમમાં, વાસ્તવિક પ્રેરક પોતે લેક્ટોઝ નથી.લેક્ટોઝ કોષમાં પ્રવેશે છે અને એલોલેક્ટોઝમાં રૂપાંતરિત થવા માટે β-galactosidase દ્વારા ઉત્પ્રેરિત થાય છે.બાદમાં, પ્રેરક પરમાણુ તરીકે, રિપ્રેસર પ્રોટીન સાથે જોડાય છે અને પ્રોટીનની રચનામાં ફેરફાર કરે છે, જે O ક્રમ અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનમાંથી રિપ્રેસર પ્રોટીનના વિયોજન તરફ દોરી જાય છે.Isopropylthiogalactoside (IPTG) એલોલેક્ટોઝ જેવી જ અસર ધરાવે છે.તે ખૂબ જ શક્તિશાળી પ્રેરક છે, જે બેક્ટેરિયા દ્વારા ચયાપચય કરતું નથી અને તે ખૂબ જ સ્થિર છે, તેથી તેનો પ્રયોગશાળાઓમાં વ્યાપકપણે ઉપયોગ થાય છે.

IPTG ની શ્રેષ્ઠ સાંદ્રતા કેવી રીતે નક્કી કરવી?ઉદાહરણ તરીકે ઇ. કોલી લો.
પોઝિટિવ રિકોમ્બિનન્ટ pGEX (CGRP/msCT) ધરાવતી E. coli BL21 આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ સ્ટ્રેનને 50μg·mL-1 Amp ધરાવતા LB પ્રવાહી માધ્યમમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવી હતી અને 37°C તાપમાને રાતોરાત સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું.ઉપરોક્ત સંસ્કૃતિને વિસ્તરણ સંસ્કૃતિ માટે 1:100 ના ગુણોત્તરમાં 50μg·mL-1 Amp ધરાવતી 50mL તાજા LB પ્રવાહી માધ્યમની 10 બોટલોમાં ઇનોક્યુલેટ કરવામાં આવી હતી, અને જ્યારે OD600 મૂલ્ય 0.6~0.8 હતું, ત્યારે IPTGને અંતિમ સાંદ્રતામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.તે 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1 છે.સમાન તાપમાને અને તે જ સમયે ઇન્ડક્શન પછી, તેમાંથી 1 એમએલ બેક્ટેરિયલ સોલ્યુશન લેવામાં આવ્યું હતું, અને બેક્ટેરિયલ કોષોને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ પર વિવિધ IPTG સાંદ્રતાના પ્રભાવનું વિશ્લેષણ કરવા માટે SDS-PAGE ને આધિન કરવામાં આવ્યા હતા, અને પછી સૌથી મોટા પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ સાથે IPTG સાંદ્રતા પસંદ કરો.
પ્રયોગો પછી, તે જાણવા મળશે કે IPTG ની સાંદ્રતા શક્ય તેટલી મોટી નથી.આ એટલા માટે છે કારણ કે IPTG બેક્ટેરિયા માટે ચોક્કસ ઝેરી છે.એકાગ્રતા ઓળંગી પણ કોષને મારી નાખશે;અને સામાન્ય રીતે કહીએ તો, અમે આશા રાખીએ છીએ કે કોષમાં વધુ દ્રાવ્ય પ્રોટીન વ્યક્ત કરવામાં આવે તેટલું સારું, પરંતુ ઘણા કિસ્સાઓમાં જ્યારે IPTG ની સાંદ્રતા ખૂબ વધારે હોય, ત્યારે મોટા પ્રમાણમાં સમાવેશ થશે.શરીર, પરંતુ દ્રાવ્ય પ્રોટીનની માત્રામાં ઘટાડો થયો.તેથી, સૌથી યોગ્ય IPTG એકાગ્રતા મોટાભાગે વધુ સારી નથી હોતી, પરંતુ એકાગ્રતા ઓછી હોય છે.
આનુવંશિક રીતે એન્જિનિયર્ડ સ્ટ્રેઇનના ઇન્ડક્શન અને ખેતીનો હેતુ લક્ષ્ય પ્રોટીનની ઉપજ વધારવા અને ખર્ચ ઘટાડવાનો છે.લક્ષ્ય જનીનની અભિવ્યક્તિ માત્ર તાણના પોતાના પરિબળો અને અભિવ્યક્તિ પ્લાઝમિડથી જ પ્રભાવિત થતી નથી, પરંતુ અન્ય બાહ્ય પરિસ્થિતિઓ જેમ કે ઇન્ડ્યુસરની સાંદ્રતા, ઇન્ડક્શન તાપમાન અને ઇન્ડક્શન સમય દ્વારા પણ પ્રભાવિત થાય છે.તેથી, સામાન્ય રીતે, અજ્ઞાત પ્રોટીન વ્યક્ત અને શુદ્ધ થાય તે પહેલાં, યોગ્ય પરિસ્થિતિઓ પસંદ કરવા અને શ્રેષ્ઠ પ્રાયોગિક પરિણામો મેળવવા માટે ઇન્ડક્શન સમય, તાપમાન અને IPTG સાંદ્રતાનો અભ્યાસ કરવો શ્રેષ્ઠ છે.